بررسی بیش بیان ژن sox2 به¬وسیله ناقل ویروسی aav-2 در سلول¬های rpe انسان بالغ

thesis
abstract

اپیتلیوم رنگدانه¬دار شبکیه چشم(rpe) یک تک لایه شامل سلول¬هایی است که نورون¬های شبکیه را محافظت می¬کنند. در طول تکوین، rpe و نورون¬های شبکیه از یک پیش¬ساز مشترک به¬نام حباب بینایی منشا می-گیرند. sox2 یک فاکتور رونویسی است که حاوی جعبه hmg است و از ژن¬های مهم در تکوین چشم می¬باشد که دیده شده در شرایط مناسب، تمایززدایی سلول¬های rpe را القا می¬کند. هدف از این مطالعه سنجش توانایی sox2 انتقال¬یافته توسط ویروس وابسته به¬آدنو(aav) در ایجاد تغییرات تمایزی سلول¬های rpe انسان بالغ می¬باشد. مواد و روش¬ها: توالی کدکننده ژن sox2 در وکتور paav-mcs همسانه¬سازی و توسط روش¬های colony pcr، هضم آنزیمی و تعیین توالی، تایید شد. جهت رهگیری بیان ژن در سلول¬های جانوری، قطعه ires-egfp نیز در وکتور بیانی همسانه¬سازی شد. محصول واکنش اتصال به باکتری e.coli منتقل و باکتری¬های تراریخت توسط آزمون استخراج quick check مشخص و با روش¬های هضم آنزیمی، واکنش زنجیره¬ای پلیمراز و تعیین توالی وکتور بیانی نهایی تایید شد. با استفاده از وکتور گزارشگر paav-lacz ترنسفکشن سلول¬های hek293t به روش کلسیم فسفات بهینه شد و این سلول¬ها توسط وکتور نوترکیب حاوی sox2-ires-egfp، paav-rc و phelper ترنسفکت همزمان شدند. ویروس¬های نوترکیب پس از 72 ساعت جمع¬آوری شدند. از سه روش رنگ¬آمیزی x-gal، فلوسایتومتری و absolute quantification real-time pcr جهت تعیین تیتر ویروس¬های مختلف تولیدشده استفاده شد. کره¬های چشم انسان بالغ از بانک چشم جمهوری اسلامی ایران فراهم و سلول¬های rpe جداسازی و کشت داده¬شدند. این سلول¬ها توسط ویروس-های نوترکیب به روش¬های مختلفی آلوده¬شدند. جهت بررسی تغییرات بیان sox2 و پیامدهای حاصل از آن، آزمون¬های real-time pcr و ایمنوسیتوشیمی استفاده شدند. نتایج: داده¬های حاصل از تعیین تیتر ویروس نشان داد استوک اولیه ویروس¬های aav-sox2 جمع¬آوری شده دارای106×8/1 ویروس با توانایی آلوده¬سازی بود. روش آلوده¬سازی سلول¬های شناور به عنوان بهترین روش آلوده¬سازی سلول¬های rpe انتخاب شد. تجزیه تحلیل داده¬های حاصل از real-time pcr نشان داد پس از مهار تکثیر سلولی، به¬دنبال افزایش بیان sox2، نستین به عنوان نشانگر سلول¬های پیش¬ساز عصبی، در سلول¬های آلوده¬شده با ویروس نوترکیب حاوی sox2 افزایش بیان پیدا می¬کند. همچنین ژن pax6 نیز تغییرات بیان معنادار باسطح اطمینان 99% نشان داد. در آزمون ایمنوسیتوشیمی بروز سلول¬های مثبت برای نشانگرهای تمایزی مانند thy1 که نشانگر سلول¬های گانگلیونی است مشاهده شد. همچنین برای اولین بار نتایج ایمنوسیتوشیمی این تحقیق تغییرات rpe به سمت سلول گیرنده نور استوانه¬ای را تحت تاثیر sox2 نشان داد. در نهایت نتایج این تحقیق نشان داد که افزایش بیان sox2 سبب القا تغییرات تمایزی سلول¬های rpe انسان بالغ می¬شود.

similar resources

بررسی بیش بیان ژن sox2 انسانی در سلولهای اپی تلیال پیگمنته شبکیه(rpe) نوزاد انسان از طریق وکتور آدنوویروسی

در این مطالعه ژن کد کننده sox2 در وکتور بیانی paav-mcs کلون شده سپس این سازه به سلول های hek293a ترانسفکت می شود سپس ویروس های تولید شده جمع آوری شده و به سلول های rpe اینفکت خواهد شد و توانایی تولید سلول های پیش ساز عصبی از سلول های اپیتلیالی رنگدانه دار بررسی خواهد شد.

همسانه‌سازی ژن SOX2 انسانی در ناقل لنتی ویروسی و القای ژنی در سلول‌های HEK293T

  چکید ه   سابقه و هدف   ژن SOX2 در میان گونه‌ها، حفاظت شده بوده و از فاکتورهای مهم در القای سلول‌های پیش‌ساز از سلول‌های تمایز یافته می‌باشد که موجب حفظ خاصیت پرتوانی سلول‌های پیش‌ساز می‌شود. SOX2 ، OCT4 ، cMYC و KLF4 سبب باز برنامه‌نویسی سلول‌های سوماتیک به سلول‌های بنیادی می‌شوند. امروزه از ژن SOX2 در جهت تولید سلول­های iPS و سلول درمانی استفاده می‌شود. در این تحقیق همسانه‌سازی ژن SOX2 در نا...

full text

بررسی اثر بیش بیان ژن sox2 در دگر تمایز سلول های رنگدانه دار شبکیه (rpe) به سلول های عصبی شبکیه

هدف: سلول های اپی تلیالی رنگدانه دار شبکیه (rpe ) یک لایه سلول رنگدانه دار در درونی ترین لایه شبکیه تشکیل می دهند. این سلول ها توانایی باز برنامه نویسی و در نتیجه تولید سلول های پیش ساز شبکیه را دارند. sox2 یک فاکتور رونیسی و یک مارکر مهم برای سلول های پیش ساز عصبی و سلول های بنیادی می باشد و سبب حفظ خاصیت پر توانی سلول های بنیادی می شود. هدف از این مطالعه تولید سلول های پیش ساز عصبی به وسیل...

15 صفحه اول

کلونینگ ژن هورمون رشد (GH) فیل ماهی (Huso huso) در سازه های لنتی ویروسی و غیر ویروسی و بررسی بیان ژن در سلولهای بنیادی جنینی انسانی

یکی از مهمترین کاربردهای مهندسی ژنتیک در تحقیقات آبزی پروری، افزایش میزان رشد ماهیان پرورشی از طریق انتقال ترنس ژنهای هورمون رشد به آنهاست. اما پیش از هر گونه تلاش در جهت انتقال ژن، ساخت و سنتز این ترنس ژنهای مطلوب الزامی است. از این رو در این تحقیق، ابتدا لنتی ویروس های نوترکیب حاوی ژن هورمون رشد (GH)فیل ماهی Huso huso به عنوان یکی از مهمترین گونه های ماهیان خاویاری تولید شد، سپس از آنها برای ...

full text

بررسی بیان نشانگرهای سلولهای بنیادی مزانشیمی در سلولهای بنیادی فولیکول موی انسان

  زمینه و هدف: سلولهای بنیادی بالغ سلولهایی تمایز نیافته اند که در مراحل خاصی از زندگی فرد یا در هنگام بروز آسیب به بدن فعال شده و سلولهای مرده و آسیب دیده را جایگزین می کنند. سلو ل های بنیادی بالغ در بخشهایی از بدن فرد بالغ وجود دارند و فولیکول مو نیز از جمله مناطقی است که دارای ذخیره ای از سلولهای بنیادی بالغ است که نقش مهمی در چرخه زندگی مو بر عهده دارند. هدف از این مطالعه جداسازی سلولهای بن...

full text

کلونینگ ژن هورمون رشد (gh) فیل ماهی (huso huso) در سازه های لنتی ویروسی و غیر ویروسی و بررسی بیان ژن در سلولهای بنیادی جنینی انسانی

یکی از مهمترین کاربردهای مهندسی ژنتیک در تحقیقات آبزی پروری، افزایش میزان رشد ماهیان پرورشی از طریق انتقال ترنس ژنهای هورمون رشد به آنهاست. اما پیش از هر گونه تلاش در جهت انتقال ژن، ساخت و سنتز این ترنس ژنهای مطلوب الزامی است. از این رو در این تحقیق، ابتدا لنتی ویروس های نوترکیب حاوی ژن هورمون رشد (gh)فیل ماهی huso huso به عنوان یکی از مهمترین گونه های ماهیان خاویاری تولید شد، سپس از آنها برای ...

full text

My Resources

Save resource for easier access later

Save to my library Already added to my library

{@ msg_add @}


document type: thesis

وزارت علوم، تحقیقات و فناوری - پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک وزیست فناوری

Hosted on Doprax cloud platform doprax.com

copyright © 2015-2023